Awalnya manga ini menceritakan tentang dua pemuda pemain sepak bola amerika yang berada di satu sekolah.Kedua pemuda ini mempunyai kemampuan yang berbeda, yang satu keahliannya di bidang tenaga dan yang satu lagi mempunyai keahlian di bidang teknik. Kedua pemuda ini mempunyai impian yaitu bermain di stadion nasional Jepang dan menjadi juara di tingkat nasional. Akan tetapi, mereka berdua tidak mempunyai tim yang lengkap untuk bermain sebagai tim yang utuh . Untuk mengatasi itu, salah satu pemuda itu mempunyai ide untuk membuat klub sepak bola amerika di sekolahnya. Akhirnya, klub itu terwujud.
Akan tetapi, pada tahun pertama, klub itu kurang diminati oleh para murid di sekolahnya,yang akhirnya membuat mereka gagal ke liga nasional. Di tahun kedua,mereka pun mencoba mencari pemain yang sesuai dengan kebutuhan mereka. Mereka pun menemukan pemain yang mereka idamkan selama ini. Dia dijuluki "Eyeshield" karena dia memakai pelindung mata pada pelindung kepalanya untuk mencegah identitas dia diketahui oleh orang lain, dan perjalanan panjang pun dimulai dari sini.
Kobayakawa Sena adalah seorang murid SMA Deimon yang lemah. Sejak SD, Sena sudah dijadikan budak oleh teman-temannya. Sena juga memiliki teman masa kecil bernama Anezaki Mamori (Anezaki Mamori) yang selalu melindunginya jika diganggu oleh anak lain. Walaupun begitu, Sena menjadi memiliki kaki yang (amat) cepat karena sering berlari. Lalu suatu saat, ketika Sena berhasil lulus tes masuk, ia dijebak Hiruma untuk mendapatkan alamat rumahnya, lalu memasukan banyak brosur klub sepak bola Amerika di rumahnya. Tapi, yang membuat dia manjadi tertarik ingin masuk klub karena dia ingin menjadi syumu (sekretaris klub) tersebut. Tapi, lama-kelamaan dia akhirnya bersemangat menjadi seorang pemain juga. Saat SD, Sena sudah dijadikan budak oleh teman-temannya. Yang menyelamatkan dia adalah Kaitani Riku, teman sekelasnya. Riku mempunyai kaki yang cepat dan dialah yang mengajarkan Sena cara lari cepat agar Sena tidak diganggu lagi oleh teman-temannya. Tapi, Sena malah menggunakana lari nya supaya lebuh cepat saat disuruh-suruh. Sayangnya, Riku hanya 2 minggu sekelas dengan Sena karena orang tuanya pindah kerja. Tapi ia akan bertemu Sena lagi dalam posisi sebagai runner back Seibu Wild Gunmans. Ia melatih kecepatan kakinya dengan teknik lari yang diajarkan Riku, selama 6 tahun,sehingga kecepatan larinya makin cepat.
Yoichi Hiruma adalah kapten tim sepak bola Amerika ini. Dia memiliki telinga yang lancip dan gigi-gigi yang tajam dan menyerupai setan. Dia juga selalu membawa senjata-senjata api kemana-mana. Dia adalah seorang yang licik dan kejam. Dia juga selalu memanfaatkan kelemahan orang lain demi mencapai keinginannya. Hiruma memiliki buku saku yang bernama "Buku Ancaman". Buku tersebut berisi rahasia-rahasia pribadi milik banyak orang. Dia menggunakannya untuk mengancam orang yang tidak mau menurutinya. Dulu tim Devil Bats ini hanya berisikan 3 orang saja, yaitu: Hiruma, Kurita, dan Musashi. Ketika bertanding, mereka selalu meminta bantuan dari klub lain. Lalu, pada akhirnya, Musashi keluar dari Deimon. Sehingga Devil Bats hanya berisi 2 orang saja. Maka dari itu, Hiruma dan Kurita selalu berusaha mendapatkan pemain, bagaimanapun caranya. Hiruma sangat JENIUS dan juga merupakan murid terpintar di SMA Deimon bersama Anezaki Mamori dan Yukimitsu Manabu, meski itu masih agak misteri. Hiruma dan Agon dari tim Shinryuji Naga adalah musuh bebuyutan. Hiruma tampak sangat membenci Agon karena Agon telah membuat Kurita tidak diterima di Shinryuji. Pada awalnya, Hiruma, Musashi dan Kurita ingin masuk SMA Shinryuji yang klub Amefuto nya sangat kuat. Musashi dan Hiruma berhasil lulus tes masuk SMA Shinryuji tetapi Kurita yang paling bodoh di antara mereka terpaksa tidak mengikuti tes, tetapi tes dalam bidang olahraga. Seharusnya Kurita bisa lulus, tetapi Agon malah memilih mengikuti tes bidang olahraga karena dia tidak suka orang seperti Kurita sehingga Kurita gagal. Hiruma adalah tokoh yang paling misterius di cerita ini karena sama sekali tidak ada keterangan apapun kecuali namanya. Dia juga sangat kasar sehingga selalu memanggil nama orang dengan tambahan "sialan". Misal untuk Sena dan Monta adalah cebol sialan, Mamori adalah manajer sialan dan Kurita adalah babi/gendut bodoh. Meski tentang keluarga Hiruma sama sekali tidak diketahui, namun sepertinya hubungan Hiruma dan ayahnya tidak baik. Sebab ketika ayah Hiruma meneleponnya (Hiruma tidak tahu, hpnya dalam keadaan voice mail, yang mendengar adalah Mamori) dia berkata, "Apa ini Youichi? Ayah menonton pertandinganmu dan ayah mengucapkan selamat karena kamu berhasil menang..Ayah tahu kamu masih membenci Ayah dan bahkan kamu tidak mau mengangkat telepon dariku.."
Ryokan Kurita adalah teman dari Hiruma. Dia adalah pemain terbesar dan terberat di Deimon Devil Bats. Ayah Kurita adalah seorang pengawas aliran Budha Morenshu. Karena menurutnya biksu masa depan harus dibesarkan menjadi kuat, ia jadi memberi Kurita makanan yang berlebihan. Kurita memang teman dari Hiruma, tetapi dia orang yang sangat baik. Saking baiknya, di versi anime dia tidak pernah menggunakan kekuatan aslinya sampai Onihei kesal padanya dan mengajarkan bahwa sebagai seorang Line dia tidak boleh merasa kasihan pada lawannya. Kurita orangnya agak pesimistis dan penakut bila akan bertanding namun bila sudah di lapangan dia akan berubah sebagai Line yang hebat. Kurita merupakan Line terbaik di Turnamen Musim Gugur, sedangkan Sena sebagai runner back terbaik.
Anezaki Mamori adalh teman sejak kecil Sena. Dia selalu melindungi Sena dari kenakalan teman-temannya. Paling sering bertengkar dengan Hiruma, manajer Devil Bats ini sangat suka ngemil kue sus sehingga sering diejek Hiruma soal makannya yang banyak (terbatas cuma untuk kue sus, dia mendapat peringkat pertama tokoh yang makan paling banyak di Eyeshield 21). Mamori merupakan blasteran Amerika-Jepang dan seperempat Amerika, karena itu rambutnya cokelat dan matanya biru karena neneknya adalah orang Amerika.Awalnya Mamori tidak tahu kalau Sena adalah Eyeshield 21, makanya dia selalu melarang Sena melakukan latihan ala sparta dengan anggota lainnya. Mamori sangat over protective terhadap Sena, karena dianggapnya Sena itu lemah, tapi setelah tahu bahwa Sena adalah Eyeshield 21, akhirnya Mamori menyesal dan tidak terlalu mengekang Sena untuk melakukan apa yang diinginkannya. Mamori adalah anggota komite disiplin yang sangat pandai dan cantik sehingga populer di kalangan anak laki-laki di SMA Deimon. Bahkan Monta, Satake, dan Yamaoka suka dengannya. Selain itu, beberapa cowok dari Shinryuji Naga seperti Agon dan Ikyuu juga tertarik padanya. Kata favorit Mamori adalah "Sena wo ijime naide!!" (=jangan ganggu Sena!). Mamori ini hampir sempurna kalau dia tidak parah dalam seni rupa hingga gambarnya jelek sejelek anak SD. Setelah mengetahui Sena adalh Eyeshield, Mamori memotong rambutnya dan berkata ia hanya ingin mengganti sudut pandangnya selama ini.
Walaupun sering bertengkar dengan Hiruma, Mamori sering menunjukkan sikap lembut pada Hiruma dan tanpa sadar sudah menjadi orang yang dekat dengan Hiruma selain Musashi dan Kurita.
Taki Suzuna adalah kapten tim cheerleader Deimon Devil Bats. Orang nya ceria, berisik, dan sangat manis. Meskipun dia sering diejek oleh yang lainnya karena dia kalah seksi dengan cheerleader Deimon lainnya, namun Suzuna ini sangat lincah dan pandai memainkan rollerblade sehingga dia selalu memakainya kemana-mana. Di anime dia diperkenalkan pada episode 22-23 yaitu pada awal episode. Namun di komik dia baru diperkenalkan pada volume 10 saat Sena tersesat di Amerika. Suzuna sangat benci dipanggil dengan marganya, Taki. Makanya dia selalu melarang Sena memanggilnya Taki-san (-san merupakan akhiran tanda hormat) meski awalnya Sena selalu malu-malu memanggilnya Suzuna, akhirnya Sena terbiasa juga. Suzuna mempunyai kebiasaan memberikan nama panggilan aneh kepada teman-temannya, seperti pada Monta (=MonMon), Mamori (=Mamo-nee), dan Hiruma (=You-nii) sehingga Monta dan Sena selalu khawatir pada keselamatan nyawa Suzuna. Suzuna tidak pernah pacaran, namun dia sangat tertarik pada masalah cinta orang lain, terutama pada Mamori. Suzuna sering bertengkar dengan Monta karena Monta sangat sebal dengan sifat Suzuna yang blak-blakan. Dia pernah salah mengira Suzuna dan Sena sedang ciuman di komik bonus peringatan 100th Down, padahal saat itu Suzuna sedang memaksa Mamori memakai seragam Eyeshield. Suzuna punya kakak yang bodoh bernama Taki Natsuhiko. Alasan bahwa Suzuna benci dipanggil Taki adalah karena mirip nama kakaknya.
Raimon Tarou aka. Monta , yang biasa dipanggil Monta adalah pemain no.80 di Deimon Devil Bats dengan posisi receiver. Awalnya Monta adalah anggota klub baseball tapi karena keahliannya cuma catching, dia cuma mendapat posisi di tim tiga. Setelah dibujuk Sena, dan tipuan dari Hiruma karena ia tahu Monta menyukai Mamori sehingga ia bilang bahwa Eyeshield adalah orang jahat yang cuma mamanfaatkan Mamori, jadi ia bilang pada Monta agar masuk klub untuk menyelamatkan Mamori. Monta sangat kesal dipanggil Monta tapi setelah diberitahu Hiruma bahwa nama itu diambil dari nama Joe Montana Monta akhirnya tidak keberatan. Monta sangat menyukai Mamori, dan selalu berusaha menarik perhatiannya walaupun selalu berakhir tragis.
Taki Natsuhiko Baru muncul di volume 10, kakak Suzuna yang bego sejati ini sangat gemar mengucapkan "AHA-HA~" dan menjuluki dirinya sebagai jenius. Sena bertemu dengannya saat ujian masuk pemain San Antonio Armadillos di Amerika. Natsuhiko tidak lulus, malah Sena yang lulus, tapi ia pergi sebelum namanya diumumkan. Natsuhiko orangnya tidak mau kalah, dan sangat dibenci oleh tiga bersaudara Ha Ha dan Monta karena sering sok akrab pada Mamori pula. Natsuhiko sering tersesat karena terlalu pd kalau naik bis, ia pasti tersasar entah ke Nagano atau daerah lain yang jauh.
Yukimitsu Manabu Yukimitsu adalah murid yang sangat pintar. Dia juga sangat rajin. Dia rajin pula latihan di klub karena ia yang paling lambat (no.2 setelah Kurita) di klub. Sebenarnya dia gagal pada tes masuk klub, tapi karena Hiruma terkesan padanya yang sudah bersusah payah stengah mati, akhirnya ia "diluluskan" oleh Hiruma. Dia sudah kelas dua, namun tetap ikut klub karena ia tidak ingin menyianyiakan masa mudanya hanya dengan belajar. Sejak kecil, Yukimitsu selalu dipaksa ibunya untuk belajar dan tidak boleh ikut klub. Setelah melihat penampilan Eyeshield 21, ia menjadi kagum dan memutuskan untuk ikut klub. Ia menyesal kenapa tidak ikut klub setahun lebih cepat karena ia tidak masuk tim reguler saat turnamen musim gugur. Ia baru masuk pada "Turnamen Kanto" saat melawan Shinryuuji Naga dan berhasil mencetak satu touch down melawan Agon dengan posisi receiver. Walaupun fisiknya tidak menunjang, tetapi kemampuannya membaca permainan dan posisi lawan (hasil dari mempelajari rekaman pertandingan sebelumnya) dan semangatnya yang luar biasa, membuat semua yang meremehkannya (Agon, Ikkyu) harus membayar mahal.
Komusubi Daikichi Cowok kuat pendek dengan hidung merah ini merupakan murid Kurita. Ayahnya seorang pekerja pemindahan rumah. Walaupun kuat, Komusubi sering merasa minder dengan tubuhnya,apalagi ketika ia akan mengahdapi Mizumachi dari Kyoshin Poseidon. Namun ia berhasil membuktikan kalau tinggi badan bukan masalah. Kata-katanya sering tidak dimengerti karena ia selalu menggunakan bahasa powerful.
